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降落數值測定儀如何測定小麥淀粉酶活力?



測量的步驟如下:

1.酶液提取:稱取25℃下萌發3~4天的小麥種子1.0g(芽長1.0~1.5cm),置研缽中,加少量石英砂和2ml蒸餾水,研磨成勻漿后轉入離心管中,用7ml蒸餾水分次將殘渣洗入離心管提取液在室溫下放置提取15~20min,每隔數分鐘攪動1次,使其充分提取。
然后在3000rpm轉速下離心10min,將上清液倒入50ml容量瓶中,加蒸餾水定容至刻度,搖勻,即為淀粉酶原液。吸取上述淀粉酶原液5ml,放入50ml容量瓶中,用蒸餾水定容至刻度搖勻,即為淀分酶稀釋液。

2.麥芽糖標準曲線制作:取7支干凈的具塞刻度試管,編號,按表33-1加入試劑。
表33-1  制作麥芽糖標準曲線配方表
試劑管號 1 2 3 4 5 6 7
麥芽糖標準液(ml) 0 0.2 0.4 0.8 1.2. 1.6 2.0
蒸餾水(ml) 2.0 1.8 1.6 1.2 0.8 0.4 0
麥芽糖含量(mg) 0 0.2 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0
3,5-二硝基水楊酸(ml) 2 2 2 2 2 2 2

搖勻,置沸水中浴中煮沸5min。取出后流水冷卻,加蒸餾水定容至20ml。以1號管作為空白調零點,在540nm波長下比色測定。以麥芽糖含量為橫坐標,吸光度值為縱坐標,繪制標準曲線。

3.酶活力的測定:取6支干凈的具塞刻度試管,編號,按表33-2進行操作。 
表33-2  配活力的測定配方表
操作項目管號 Ⅰ-1 Ⅰ-2 Ⅰ-3 Ⅱ-1 Ⅱ-2 Ⅱ-3 
淀粉酶原液(ml) 1.0 1.0 1.0 0 0 0
鈍化β-淀粉酶 置70℃水浴中15min,取出后在流水中冷卻
淀粉酶稀釋液(ml) 0 0 0 1 1 1
DNS試劑(ml) 2.0 0 0 2.0 0 0
預保溫 40℃恒溫水浴中保溫10min
1%淀粉溶液(ml)(40℃) 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
保溫 40℃恒溫水浴中準確保溫5min
DNS試劑(ml) 0 2.0 2.0 0 2.0 2.0

搖勻,置沸水浴中5min,取出后冷卻,加蒸餾水至20ml。搖勻,在540nm波長下比色,記錄測定結果。

4.結果計算:用Ⅰ-2、Ⅰ-3吸光度平均值與Ⅰ-1吸光度值之差,在標準曲線上查出相應的麥芽糖含量(mg),再按下式計算α-淀粉酶的活力(Aα),淀粉酶活性以麥芽糖mg·g-1·min-1表示:
Aα=
Ⅱ-2、Ⅱ-3吸光度平均值與Ⅱ-1吸光度值之差,在標準曲線上查出相應的麥芽糖含量(mg),按下式計算(α+β)-淀粉酶總活力AT:
AT=
式中  A—淀粉酶活性,Aα為α-淀粉酶的活性,AT為淀粉酶總活性,主要是α、β淀粉酶的活性;
Cα—α-淀粉酶水解淀粉生成的麥芽糖量(查標準曲線求值,以下同);
CT—(α+β)淀粉酶共同水解淀粉生成的麥芽糖量;
V1—顯色所用酶液體積(ml);
t—酶作用時間(min);
Vt—樣液稀液總體積(α-淀粉酶為50ml,α+β淀粉酶為500ml);
FW—樣品鮮重(g)。

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